薄層層析是一種微量而快速的層析方法。**早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化鋁薄層分離了植物提取液。層析是在吸附劑或支持劑均勻涂布的薄層上進行的，故稱薄層層析。
為了使所要分析的樣品各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺是廣泛采用的吸附劑，硅藻土和纖維素是分配層析中**常用的支持劑，在吸附劉或支持劑中添加了適合的粘合劑再涂布，可使薄層粘牢在玻璃板（或滌綸片基）這類基底上。
硅膠G是一種添加了粘合劑的硅膠粉，約含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物質從溶液中吸附于自身的表面上，利用它對各種物質的吸附能力不同，再用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng)展層使不同的物質得以分離。例如糖在硅膠G薄層上的移動速度與糖的分子量和羥基數(shù)有關，經(jīng)過適當?shù)娜軇┱归_后，糖在薄板上的移動速度是戊糖>己糖>雙糖>三糖。若用硼酸溶液市制硅膠G可改進分離效果。對己分開 的斑點顯色，而將與它位置相當?shù)牧硪粋€未顯色的斑點從薄層上與硅膠G一起刮下，以適當?shù)娜軇⑻菑墓枘zG上洗脫下來，就可用糖的定量測定方法各組分的含糖量。
薄層層析一般采用上行法，在具有密閉蓋子的玻璃缸中進行，溶劑倒于缸底，簡單地將薄板放入即可。保證層析缸內有飽和的蒸氣是實驗成功的關鍵。保證措施是在層析缸內壁襯一層浸濕溶劑的濾紙或縮小層析缸的容積。因為層析時，溶劑會從薄層上蒸發(fā)，樣品移動到一定距離的時間就會處長。若所用溶劑系統(tǒng)由幾個成分組成，揮發(fā)性較大的成分shou先蒸發(fā)，就會使混合溶劑的組分改變，而溶劑的蒸發(fā)從薄板的中央向兩邊遞減，致使溶劑前沿呈彎曲狀，結果往往是使兩邊的Rf值大于中央位置的Rf值。
薄層層析與其它方法比有明顯的優(yōu)點：層析時間短，可以分離多種化合物，用樣品量少（微克級），與紙層析相比要靈敏10-100倍，觀察結果方便，顯色方法甚**可以用腐蝕性顯色劑。
取硅膠G粉30g加75毫升0.1mol/L硼酸溶液，調勻后鋪于潔凈平整的玻板上，鋪層后的薄板于100oC烘箱中烘干。取出后可用，亦可貯于干燥器中備用。薄層表面要求平整，厚薄均勻。2． 糖在硅膠G薄層上的分離
選制備好的薄板一塊，在距底邊1.5cm的直線上選四個點，相互距離2cm。用毛細管分別點上不同的糖樣品于四個點，樣量控制在5-50µɡ，斑點直徑不超過2mm。待薄層上樣品自然干燥后，將薄板置于盛有層析溶劑的層析缸中，自下向上展層，當展層溶劑到達離薄板項端約1cm處時取出薄板，前沿作一記號，60oC烘干2-3小時（或空氣中晾干），除盡溶劑后均勻地噴上苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑，85oC烘10分鐘，各種糖則分別顯出不同的顏色。記下各斑點的位置、顏色，計算Rf值。
糖的硅膠G薄層層析
一. 目的
糖類是自然界存在的數(shù)量**多的有機化合物,它既是植物軀體和細胞的結構成份,又是 生命活動能量的主要來源,并且與植物體內各類物質的代謝密切相關,分離鑒定植物組織中 可溶性糖的種類及其變化,對了解植物體內的組織代謝和農(nóng)產(chǎn)品的品質,具有重要意義. 本實驗采用硅膠G薄層層析法,分離鑒定植物組織中可溶性糖的種類,要求通過本實驗, 學習提取植物材料中可溶性糖的一般方法,掌握吸附薄層層析的原理,操作及其在糖類鑒定 中的作用. 二. 原理
植物組織中的可溶性糖可用一定濃度的乙醇提取出來,經(jīng)除去雜質,即可獲得較純的可 溶性糖混合物.
薄層層析是層析法的一種,層析法是利用被分離樣品混合物中各組分的物理,化學差別, 使各組分以不同程度分布在兩個 相 中,這兩個相通常使一個被固定在一定的支持物上的, 稱為固定相;另一個是移動的,稱為流動相;當流動相流過固定相時,在移動過程中由于各 組分在兩相中的分配情況不同,或吸附性質不同,或電荷分布不同,或離子親和力不同等, 而以不同速度前進,從而達到分離的目的.
薄層層析是一種快速而微量的層析方法,它是將一種固定支持物均勻地涂在薄板上,對 物質進行層析的方法,本實驗只討論吸附薄層層析,即所有支持物是吸附劑(如硅膠粉), 層析時,主要是根據(jù)吸附劑對樣品中各組分的吸附能力不同,因此個組分的移動速度不同, 從而達到分離混合物的目的.
糖為多羥基化合物,具有較強的極性,在硅膠G薄板上展層時,糖與硅膠分子有一定的吸附力.硅膠分子與糖的吸附能力大小取決于糖的分子量和羥基數(shù)目,不同的糖分子由于分 子量及羥基數(shù)的不同,因而它與硅膠分子間的吸附力不同.造成各種糖分子在展層過程中移 動的距離不同,從而將各種糖分離出來,一般吸附力的大小為:三糖>雙糖>己糖>戊糖.其 中各種糖移動的速率可用Rf值表示.通過與標準糖的Rf值比較.即可鑒定出植物組織提取 液中糖的種類.
溶質斑點中心到樣點的距離 Rf( 值) = 溶劑前沿到點樣點的距離 三. 實驗材料,儀器和試劑 1. 材料:蘋果或其他植物材料 2. 儀器:
(1) 離心機及離心管 (2) 藥物天平 (3) 研缽 (4) 量筒 25ml (5) 移液管 10ml (6) 恒溫水浴 (7) 毛細管 (8) 層析缸 (9) 吹風機 #p#分頁標題#e#
(10) 玻璃板 :7 15cm (11) 烘箱 (12) 噴霧器
(13) 燒杯 50ml,100ml 鉛筆,尺子 3.試劑 (1) 無水酒精 (2) 氯仿 (3)冰醋酸
(4)1%標準糖溶液(10mg/ml):木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖等.
(5)苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑:2克二苯胺,加2ml苯胺,10ml 85%磷酸,1ml 濃HCl,100ml丙酮,溶后搖勻. (6)0.1M硼酸溶液 四. 操作步驟 1. 板的制備:
取硅膠G粉2克(或硅膠H粉1.7克+無水CaSO4 0.3克),加01M硼酸溶液4.5ml于 研缽中充分研磨成糊狀時,傾倒在薄板上(玻璃板須表面平整,光滑,清潔.即光用洗 液或其他洗滌液浸泡,洗凈,晾干,否則吸附劑容易剝落),可鋪7 15厘米薄板兩塊 并馬上用玻璃棒涂勻,然后用手輕輕傾斜玻璃板,使糊狀吸附劑在整塊板上分布均勻,表面平坦光滑,加硼酸攪拌及研磨的時間和鋪板的速度是涂層鋪板的關鍵之一,一般研 磨到吸附劑為硼酸液所飽和時粘度**大,發(fā)出如脂肪光澤時,立即涂勻為**好.將制好 的薄板置于水平臺上自然晾干后,用前于110℃烘箱中活化一小時使用. 2. 水果中可溶性糖提取液的制備
取洗凈的蘋果(或其他水果)削去果皮,稱3g果肉在研缽中研成勻漿后,倒在雙層洗 凈的紗布上.包起置于漏斗,用干凈玻璃棒將果汁壓出.取果汁1ml于離心管中,加無 水乙醇3ml,充分混勻后,在3000轉/分下離心20分鐘,上清夜即為可溶性糖提取液. 3. 蘋果提取液中可溶性糖的分離鑒定
取活化后的硅膠G板一塊,距底邊1.5厘米水平線上確定5個點,相互間隔1厘米,其 中4個點,分別點上5%的木糖,葡萄糖,果糖,蔗糖標準溶液數(shù)滴,另一點點上蘋果 提取液數(shù)滴.在用毛細管點樣時,毛細管應垂直于硅膠G板的方向點樣,而且毛細管接 觸G板的時間應盡量短,不然點樣斑點直徑難以控制,以氯仿:冰醋酸:水=30:35: 5為展層劑上行展層,當展層前沿達距薄板頂端1厘米處,取出玻板用吹風機吹干,然 后以苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑噴霧,于85℃烘箱中10分鐘,各種糖即顯示出不同色 斑與標準糖比較,根據(jù)斑點顏色及Rf值即可鑒定出蘋果提取液中所存在的可溶性糖的 種類. 五. 結果
顯色后繪出層析板圖譜或照相,并計算各點Rf值. 糖的硅膠G薄層層析分離與定性,定量鑒定 【目的和要求】
1.了解并初步掌握吸附層析的原理.
2.學習薄層層析的一般操作及定性與定量鑒定的方法. 【原理】
薄層層析是一種廣泛應用于氨基酸,多肽,核苷酸,脂肪類,糖
脂和生物堿等多種物質的分離和鑒定的層析方法.由于層析是在吸附 劑或支持介質均勻涂布的薄層上進行的,所以稱之為薄層層析. 薄層層析的主要原理是,根據(jù)樣品組分與吸附劑的吸附力及其在 展層溶劑中的分配系數(shù)的不同而使混合物分離.當展層溶劑移動時, 會帶著混合樣品中的各組分一起移動,并不斷發(fā)生吸附與解吸作用以 及反復分配作用.根據(jù)各組分在溶劑中溶解度不同和吸附劑對樣品各 組分的吸附能力的差異,**終將混合物分離成一系列的斑點.如果把 標準樣品在同一層析薄板上一起展開,便可通過在同一薄板上的已知 標準樣品的Rf值和未知樣品各組分的Rf值進行對照,就可初步鑒定 未知樣品各組分的成分.
薄層層析根據(jù)所支持物的性質和分離機制的不同包括吸附層析, 離子交換層析和凝膠過濾等.糖的分離鑒定可用吸附劑或支持劑中添 加適宜的黏合劑后再涂布于支持板上,可使薄層粘牢在玻璃板(或滌淪片基)這類基底上.
硅膠G是一種已添加了黏合劑 石膏(CaSO4)的硅膠粉,糖
在硅膠G薄層上的移動速度與糖的相對分子質量和羥基數(shù)等有關,經(jīng) 適當?shù)娜軇┱归_后,糖在硅膠G薄析上的移動距離為戊糖>已糖>雙糖 >三糖.若采用硼酸溶液代替水調制硅膠G制成的薄板可提高高糖的 分離效果.如對已分開的斑點顯色,而將與它位置相當?shù)牧硪粋€未顯 色的斑點從薄層上與硅膠G一起刮下,以適當?shù)娜芤簩⑻菑墓枘zG上 洗脫下來,就可用糖的定量測定方法測出樣品中各組分的糖含量. 薄層層析的展層方式有上行,下行和近水平等.一般常采用上行 法,即在具有密閉蓋子的玻璃缸(即層析缸)中進行,將適量的展層 溶液倒于缸底,把點有樣品的薄層板放入缸中即可(如圖1所示). 保證層析缸內有充分展層溶劑的飽和蒸氣是實驗成功的關鍵. 與紙層析,柱層析等方法比較,薄層層析有明顯的優(yōu)點:操作方 便,層析時間短,可分離各種化合物,樣品用量少(0.1**幾十向微 克的樣品均可分離),比紙層析靈敏度高10～100倍,顯色和觀察結 果方便,如薄層由無機物制成,可用濃硫酸,濃鹽酸等腐蝕性顯色劑. 因此,薄層層析是一項實驗常用的分離技術,其應用范圍主要在生物 化學,醫(yī)藥衛(wèi)生,化學工業(yè),家業(yè)生產(chǎn),食品和毒理分析等*域,對 于天然化合物的分離和鑒定也已廣泛應用. 【操作方法】
1.硅膠G薄層板的制備
將制備薄層用的玻璃板預先用洗液洗干凈并烘干,玻璃板要求表 面光滑.
稱取硅膠G粉6g,加入12mL 0.1mol/L硼酸溶液,用玻棒在燒 杯中慢慢攪拌**硅膠漿液分散均勻,黏稠度適中,然后傾倒在干凈, 干燥的坡璃板上,傾斜玻璃或用玻棒將硅膠G由一端向另一端推動, 使硅膠G鋪成厚薄均勻的薄層.待薄板表面水分開干燥后置于烘箱 內,待溫度升**110℃后活化30min.冷卻**室溫后取出,置于干燥 器中備用(注意:避免薄板驟熱,驟冷使薄層斷裂或在展層過程中脫 落).制成的薄層板,要求表面平整,厚薄均勻. 手工涂布薄板的方法: #p#分頁標題#e#
(1)玻棒涂布:選用一根直徑為1～1.2cm的玻璃棒或玻璃管在 兩端繞幾圈膠布,膠布的圈數(shù)視薄層的厚度而定,常用厚度為0.56～ 1.0mm,把吸附劑倒在玻璃板上,用這根玻璃棒在玻璃上將吸附劑向 一個方向推動,即成薄板.
(2)傾斜涂布:將吸附劑漿液倒在玻璃上,然后傾斜使吸附劑 漫布于玻板上面成薄層. 2.點樣
取制備好的薄板一塊,在距底邊1.5cm處劃一條直線,在直線上 每隔1.5～2㎝作為一記號(用鉛筆輕點一下,不可將薄層刺破),共 4個點.用0.5mm直徑的毛細管吸取取糖樣品量約5～50 g,點樣體 積約1-1.5 L,可分次滴加,控制點樣斑點直徑不超過2mm.在點 樣過程中可用吹風機冷熱風交替吹干樣品,也可以讓樣自然干燥. 3.展層
將已點樣的薄板點樣一端放入盛有展層溶劑的層析缸中,展層液 面不得超過點樣線,層析缸密閉,自下向上展層,當展層溶劑到達距 薄析頂端約1cm處時取出薄板,前沿用鉛筆或小針作一記號.60℃烘 箱內烘干或晾干.
4.將苯胺-二苯胺磷酸顯色劑均勻噴霧在薄層上,置85℃烘箱內 加熱**層析斑點顯現(xiàn)(如圖2所示),此顯色劑可使各種糖顯現(xiàn)出不 同的顏色,如表1所示. 表1
糖的種類 木糖 葡萄糖 蔗糖 顯色 黃綠 灰藍色綠 藍褐 5.樣品中糖定性鑒定
薄層顯色后,根據(jù)各顯色斑點的顏色相對位置,測算Rf值 將混合樣品圖譜與標準樣品圖譜相比較或通過混合樣品與標準 樣品Rf值的比較,確定混合樣品中所分離的各個斑點分別為何種糖. 6.定量測定
【影響Rf值的因素如下】
①展層溶劑的樣品組分的性質:樣品組分若在固定相中溶解度較 大,在流動相中溶解度小,則Rf值小;反之,Rf值大.②吸附劑的性 質和質量:不同批號和廠家的產(chǎn)品,其性質和質量不盡相同.③吸附 劑的活度.④薄層的厚度.⑤層析槽的形狀,大小和飽各度.⑥展層 方式.⑦雜質的存在和量的多少.⑧展層的距離.⑨樣品量.⑩溫度. 由于影響Rf值因的因素很多,故不能僅根據(jù)Rf值來鑒定未知樣品組 分.一般采用幾種薄層層析法來確證樣品的未知組分,如一種用吸附 薄層層析,另一咱用聚酰胺薄層層析等.實踐中,也可把未知樣品與 標準品混合點樣,然后進行薄層層析.如果在幾個不同類型的薄層層 析中,兩者都不發(fā)生分離,則可證明這兩個化全物是相同的. 【注意事項】
1.制備薄板時,薄板的厚度及均一性對樣品的分離效果和Rf值的 重復性影響很大,普通薄層厚度以250 m為宜.若用薄層層析法制 備少量的純物質時,薄厚度可稍大些,常見為500～700 m,甚**1～2㎜.
2.活化后的薄層析在空氣中不能放置太久,否則會因吸潮降低活 性.
3.用于薄層層析的樣品溶液的質量要求非常高,樣品中必須不含 鹽,若含有鹽分則會引起不嚴重的拖尾現(xiàn)象,甚**有時得不到正確的 分離效果.
4.樣品溶液應具有一定的濃度,一般為1～5g/L,若樣品太稀, 點樣次數(shù)太多,就會影響分離效果,所以必須進行濃縮處理. 5.樣品的溶劑**好使用揮發(fā)性的有機溶液(如乙醇,氯仿等), 不宜用水溶液,因為水分子與吸附劑的相互作用力較弱,當它點據(jù)了 吸附表面上的活性位置時,就使吸附劑的活性降低,從而使斑點擴散. 6.樣品點樣量不宜太多,若點樣量超載(即超過該吸附劑負載能 力),則會降低Rf值,層析斑點的形狀被破壞.點樣量一般為幾到幾 十 g,體積為1～20 L.
7.展層必須在裝閉的器皿中進行,器皿事先應用展層溶液劑飽 和,把薄板的點樣端浸入展層劑中,深度約為0.5～1.0cm.千萬勿 使點樣斑點浸入展層溶劑中. 8.展層溶劑的選擇:
(1)根據(jù)溶劑的結構,性質的不同而定,主要以溶液劑的極性 大小為依據(jù).在同一吸附劑上,溶劑極性越大,對同一性質的化合物 的洗脫能力也越大,即在薄層板上把這一化合物推進得越遠,Rf值也 越大.如果發(fā)現(xiàn)用一種溶液支展開某一化合物,其Rf值太小,則可考 慮換用另一種極性較大的溶劑,或在原來的溶劑中加入一定量極性較 大的溶液進行展層.溶液極性極大小次序如下:水>甲醇>正丙醇>丙 酮>乙酸甲酯>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>三氯甲烷>苯>三氯乙烯>四氯化 碳>二硫化碳>石油醚.
(2)根據(jù)被分離物質的極性和吸附劑的性質而定.在同一吸附 劑上,不同化合物的吸附規(guī)律是:①飽和碳氫化合物不易吸附或吸附 不牢.②不飽和碳氫化合物被吸附,含雙鍵越多,吸附得越牢.③碳 氫化合物被一個功能基取代后,其吸附性增大.各功能基使吸附性增 大的遞增順序是:
在薄層上,對于吸附較大合物,一般需用極性較大的溶劑(展層 劑)才能推動它.表2列出一些物質的展層溶液系統(tǒng). (3)若樣品組分具有酸堿性,則可將展層的pH值作適當調整. 若樣品組分為堿性,則調節(jié)展層溶劑 pH為堿性,以增加展層溶液的 分辨率,使樣品在薄板上展層后,斑點圓而集中,避免拖尾現(xiàn)象.當 樣品組分具有酸性時,調節(jié)展層溶劑pH為酸性,可得到圓而集中的斑點.
9.在薄層層析時,層析缸溶劑飽和度對分離效果影響較大,在不 飽和層和析缸中,展層易引起邊緣較應,因為極性較弱的溶液和沸點 較低的溶劑在邊緣揮發(fā)得快,從而使樣品組分在邊緣的Rf值高于中部 的Rf值,用飽和的層析缸可以消除邊緣效應.
10.為了獲得更好的薄層層析的效果,也可采用雙向展層,多次 展層和連續(xù)展層.多次展層是指選用一種溶劑展開**一定距離后,將 薄層板取出,待溶劑揮發(fā)后再按同一方向用第二種溶液展開. 11.薄層層析展開后,對被分離的樣品組分進行定性或定量分析, 都要用不同的顯色方法先確定它們的位置.有的物質在紫外燈下可顯 示出熒光斑點,如核苷酸等;對于在紫處光下不顯熒光的樣品,可用 熒光薄層檢出,該薄層的制法是將熒光物質(1.5%硅酸鎘粉)加入吸 附劑中,或在薄板上噴0.04%熒光鈉水溶液,0.5%硫酸奎寧醇溶液及 1%磺基水楊酸的丙酮溶液;有的有色物質在展層后可顯示有顏色的斑 點;對無色化合物的顯色,主要采用兩種方法,即物理方法和化學方 法.物理方法如用紫外燈照射,屬非破壞性顯色方法.化學方法如用 茚三酮顯色劑噴霧顯色可使氨基酸類化合物顯色;對于無機吸附劑制 成的薄層,可用強腐蝕性顯色劑如硫酸,硝酸或其他混合溶液,因為 這些顯色劑幾乎可使所有機化合物轉變成碳,為破壞性顯色方法,此 類顯色劑稱為**顯色劑,但它們不適用于定量測定或制備用的薄層 上. #p#分頁標題#e#
【材料與試劑】
1.實驗材料:木糖(或棉子糖),葡萄糖,蔗糖,混合樣品,硅 膠G 2.實驗試劑
(1)1%糖標準溶液:取木糖(或棉子糖),葡萄糖,蔗糖各1g, 分別用75%乙醇溶解并定容到100mL .
(2)1%糖標準混合溶劑:取上述各種糖各1g,混合后用75%乙 醇溶解并定容**100mL. (3)0.1mol/L硼酸(H3BO3)溶液. (4)展層溶劑:氯仿:甲醇=60:40(V/V).
(5)苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑:1g二苯胺溶于由1mL苯胺,5mL 85%磷酸,50mL丙酮組成的混合溶液中. 【實驗器材】
①燒杯;②玻璃板(8cm 12cm);③層析缸( 15cm 30cm); ④毛細管( 0.5mm);⑤玻棒;⑥噴霧器;⑦烘箱;⑧尺,鉛筆;⑨ 干燥器.
TLC中展開劑的選擇
做分離時跑板子是常有的事，展開劑的選擇就**關重要了。
選擇適當?shù)恼归_劑是shou要任務.一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇.使用單一溶劑往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，展開劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就shou先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。展開劑的選擇條件：①對的所需成分有良好的溶解性；②可使成分間分開；③待測組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測定在0.3～0.5之間；④不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學反應；⑤沸點適中，黏度較小；⑥展開后組分斑點圓且集中；⑦混合溶劑**好用新鮮配制。 一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到**佳效果。我們在實驗中，為了實現(xiàn)一個配體與其他雜質有效分離，曾經(jīng)嘗試了很多種的溶劑組合，**后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶劑。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例（或者加入第三種溶劑）,達到**佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），**好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質，在展開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質來中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質量很有關系：不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產(chǎn)品在某個廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質含量對分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實驗中我們發(fā)現(xiàn)有時同一展開條件，上下午的Rf截然不同 。 談薄層色譜展開劑選擇 (轉)
根據(jù)本人的幾年薄層層析經(jīng)驗，參考藥典等*家藥品標準和有關文獻，將 2000版藥典一部里部分有代表性的對照品的薄層層實例按展開劑極性排序，并對其規(guī)律做一些分析。以下的分析和介紹是總體描述性的，目的是快速、簡便地選擇展開劑。如果想了解展開劑選擇的各種理論，請參考其他專著。
選擇展開劑，要依據(jù)溶劑極性和他們的混溶性，溶劑對被分析物的溶解性，以及被分析物的結構。這里只討論藥典里通常使用的以硅膠為固定相主體的正相薄層，也不考慮板的活性。 列出溶劑極性參數(shù)表，方便以下比較展開劑。環(huán)已烷 :-0.2、石油醚（Ⅰ類，30~60℃）、石油醚（Ⅱ類，60~90℃）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2 [1] 。
關于溶劑混溶性，一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶，比如正己烷與甲醇。多元展開劑，主體的兩種溶劑不能混溶，就需要通過第三種溶劑來調和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環(huán)已烷和甲醇、水之類的。
一般正相色譜，固定相為極性，被分析物質的極性越大，需要極性更大的展開劑。 了解被分析物的極性可以通過分析其結構獲得，很難獲得它的極性指數(shù)。物質分子化學結構中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。 ， 依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。
相應展開劑分別為：正己烷—乙醚—冰醋酸 (5:5:0.1)、苯－冰醋酸－甲醇(30:1:3)、氯仿－甲醇－甲酸（9:1: 0.5）、石油醚－乙酸乙酯－甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯－甲酸－水(7:2.5:2.5)。（由于薄層板、比移值不同的原因，展開劑極性比較是相對的，并非**的后者大于前者）。 現(xiàn)在**重要的問題是，不同化合物，怎么定它的極性，又用什么標準來定它對應的展開劑呢？以下分開討論不同化合物極性情況及其對應的展開劑。 #p#分頁標題#e#
shou先是極性較小的揮發(fā)性物質。比如：冰片：石油醚 (30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚：苯－醋酸乙酯(9:1.5)、α-香附酮：苯－醋酯乙酯－冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：環(huán)己烷－醋酸乙酯(3:1)，這類化合物，以石油醚、正構烷和苯為體積百分數(shù)比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而用醋酸乙酯為調節(jié)Rf（比移值）的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當加入添加劑，如有機酸或者有機堿。
極性較小的不揮發(fā)性物質。比如：β -谷甾醇：環(huán)己烷－醋酸乙酯－甲醇(6:2.5:1)或者環(huán)己烷－丙酮(5:2) 、熊果酸：甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(12:4:0.5)、齊墩果酸：氯仿－甲醇(40:1)、豬去氧膽酸：氯仿－乙醚－冰醋酸(2:2:1)、大黃素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇 (8:1)、丹參酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4) 、穿心蓮內酯：氯仿-無水乙醇(9:1)、靛玉紅、靛藍氯仿－乙醇(9:1)或者苯－氯仿－丙酮(5:4:1)。這類物質展開劑極性比極性較小的揮發(fā)性物質洗脫力強一些，因為這類物質極性小的母核大，而極性大的基團通?？梢孕纬蓺滏I，比如羧酸、羥基。以上物質，母核分子量減小、母核結構中不飽和健的增加（尤其是出現(xiàn)苯環(huán)），極性基團的增加，都使極性增加，展開劑極性也增大。這個范圍內的物質很多，一般展開劑大百分數(shù)的溶劑可以從環(huán)己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的順序，按照極性要求選擇。這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數(shù)也比較小，在這范圍的化合物很少用，因為粘性大、展開慢，造成斑點擴散；另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。調節(jié)Rf值的溶劑，從醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。揮發(fā)性物質也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發(fā)性就可以明白，分子間作用力不強，另外，母核與石油醚、正構烷和苯的結構差異小，估計更容易脫離硅膠吸附，更快進入溶劑中，而不需要通過提高展開劑的極性。 皂苷類。人參皂苷：氯仿－甲醇－水 (65:35:10)10℃以下放置的下層溶液或正丁醇－醋酸乙酯－水(4:1:5)的上層溶液或氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水(15:40:22:10)10℃以下放置的下層溶液、芍藥苷：氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸(40:5:10:0.2)、黃芩苷：醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯—醋酸乙酯—甲酸—水(1:12:2.5:3)的上層溶液、葛根素：氯仿－甲醇－水(14:5:0.5)、蘆?。捍姿嵋阴ィ姿幔?8:1:1)。這類物質，由于存在糖的多羥基結構，苷元的結構影響變小。展開劑中使用極性大的有機溶劑（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。 極性大的小分子有機酸。沒食子酸：氯仿－醋酸乙酯－甲酸 (5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。這類物質多數(shù)是苯乙烯母核的，這個結構的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團，個別有多羥基配基。皂苷的展開劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。
含氮有機物。鹽酸小檗堿：苯－醋酸乙酯－甲醇－異丙醇－濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和) 或正丁醇－冰醋酸-水(7:1:2)、麻黃堿：氯仿－甲醇－濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇－冰醋酸－水(8:2:1)、甘草酸銨：醋酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水(15:1:1:2)。由于NH2硅醇基的作用很強，在強極性展開劑加有機酸、有機堿掃尾。對于極性化合物，使用正丁醇對斑點擴散影響較小，因為化合物和硅膠的作用強。
進行薄層分析基本可以根據(jù)母核、基團，選擇相似的化合物對號入座。當然，具體的條件優(yōu)化則需要根據(jù)實際情況了。遇到較困難的分離，需要使用到設計優(yōu)化方法的，已經(jīng)不屬于本文討論范圍了。
什么是薄層層析？原理是什么？
薄層層析又叫薄層色譜，是色譜法中的一種，是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，屬固—液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚**0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，又可用來精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質。此外，薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種“預試”。 薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固－液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。
一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚**0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，在進行化學反應時，常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否完成。
薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10×3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。#p#分頁標題#e#
薄層層析法具體操作注意事項
鋪板
鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進一步影響上樣量。涂層薄，點樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質量對薄層鑒別的影響不是很大，影響**大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。
點樣
盡量用小的點樣管。如果有足夠的耐性，**好只用1微升的點樣管。這樣，點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點樣斑點擴散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點好樣的薄層板用電吹風的熱風吹干或放入干燥器里晾干。
展開劑配制
選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。**不應該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準確度對不同的分析任務有不同的要求，盡量達到實驗室儀器的**高精確度，比如：取
1ml的溶劑，應使用1ml的單標移液管，移液管應符合計量認證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。
展開系統(tǒng)的飽和
一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達到飽和，防止邊沿效應，飽和時間在半個小時左右。展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當然動作應該盡量輕、快。
溫濕度的控制
溫濕度對薄層影響都很大。不凍結的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導致選擇性（容量因子）的變化，濕度應根據(jù)實際情況確定。溫度控制使用空調器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應濃度的硫酸。
顯色
噴顯色劑顯色**重要是有好的霧化器
常說的過柱子應該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相 的吸附柱。
柱子可以分為：加壓，常壓，減壓。
壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所 以其他條件相同的時候，常壓柱是效率**高的，但是時間也**長，比如天然化合物的分 離，一個柱子幾個月也是有的。
減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚**更多，但是由于大量的空氣通過 硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得 不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過 減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過減壓的念 頭了。
加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力 的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解 的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得 加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。
關于柱子的尺寸，應該是粗長的**好。
柱子長了，相應的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點就?。ǚ从吃谥由暇褪?樣品層比較薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二 厘米，那么分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只 有0.5厘米，那么各櫸志捅冉先菀椎玫酵耆擲肓?。当然采用磮?zhí)蟮鬧右冉隙?的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說， 不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費）。
現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選 擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質 相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子 ）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也 可以減小淋洗劑的極性等等。
關于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品。
可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前**少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和硅 膠飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也 是因為分離的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。**于是 加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯 色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準備幾十 個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之后就知道樣品在哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個schlenk，現(xiàn)在只一個就能把所要的全收集到。 #p#分頁標題#e#
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為硅膠中有大量的羥基裸露在外， 很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中 性和酸性的，選擇余地比較大，但是比硅膠要貴些。 聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一 照就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。
※ 關于濕法、干法上樣。
濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好 ，不然溶劑就成了淋洗劑了。 很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一 般都是比較大量的樣品才會出現(xiàn)，是因為硅膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較 好的固體才會發(fā)生，這就應該先重結晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結晶 那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。 有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起走， 顯色是一個很長的脫尾），這時就必須用干法上柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是1： 1，我覺得是越少越好，但是要保證在旋干后，不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣 品沒有吸附在硅膠上）。
溶劑的選擇。當然是**便宜，**安全，**環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻中有寫用 正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因 為極性很小，有時還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別 讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸 附是一個放熱過程，所以夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時候會好一些 。甲醇，據(jù)說能溶解部分的硅膠，所以產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神，應該經(jīng)過后 繼處理，比如說重結晶等。其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。 由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑 料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色 的雜質，其他的雜質就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過 原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。
另外溶劑在過柱子后**好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費，缺點 是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，石油醚和 乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會導**性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋 洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子后，溶劑**后回收要采用常壓，因為 在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來，常壓時就會減少這種現(xiàn)象，如果雜質和 你下面要過的樣品有反應那就慘了。
關于操作問題。 1 裝柱。
柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。 干法和濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊 密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側斜著下來）。書中寫 的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就 全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是 開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚**作廢！
2 加樣。
用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降**石英砂面時，再 加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2～4cm就夠了） ，再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。
3 淋洗劑的選擇。
感覺上要使所需點在rf0.2～0.3左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開，過 柱子就用那種極性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因為柱子是一 個多次爬板的狀態(tài)，可以通過公式的比較：0.6/0.8一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3 ）的三次方或四次方大。
4 樣品的收集。
用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比 較強的話，就不容易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點先出，而前面的點后出。這時可以 采用氧化鋁作固定相。
另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就 收到了三個樣品，wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。
5 **后的處理
柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質也會累積到產(chǎn)品中，所以如果想送 分析，**好用少量的溶劑洗滌一下，因為大部分的雜質是溶在溶劑里的，一洗基本就沒 了，必要時進行重結晶。 另外，再過柱的時候，有時會出現(xiàn)氣泡，一是 和使用的溶劑有關，如果是易揮發(fā)的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在 #p#分頁標題#e#
室溫稍高的情況下，很容易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因此，在室溫高的時候， 可以選擇沸點較高，揮發(fā)相對小的溶劑。還有，使用混合溶劑時，使用 的兩種溶劑的沸點應該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而 乙醚卻要選擇30－60的石油醚。二是：不論是用帶砂板的還是塞棉花的， 在裝柱之前，都要將空氣用加壓方法將空氣排干，這樣就可避免柱中有 空氣！過柱子需要耐心，不要著急.
