1、研究意義與前景   

 層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。【1】  

紙層析法（paper chromatography）是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于蛋白質的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動相。【2】 

 

分配層析法 分配色譜系色譜法之一種，利用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實現分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔體表面。分配色譜過程本質上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達到溶解平衡的過程。【3】 

 

2、實驗目的 

     （1）掌握分配層析的原理，學習氨基酸紙層析法的操作技術（包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量） 

     （2）學習未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。  

3、實驗原理 

      層析法也稱色譜法，是1906年俄*植物學家Michael Tswett發現并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。 后來無色物質也可利用吸附柱層析分離。 1944年出現紙層析。以后層析法不斷發展，相繼出現氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。 層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。按層析過程的機理分類： 

 吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。  分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。  離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。  

凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同   

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，它是利用不同的氨基酸在展層溶劑中的分配系數不同而得以分離的一種方法。惰性支持物是新華一號濾紙，其上含有很多的羥基，與水有較強的親和力因此把它看成是含有靜止水相的惰性支持物。水相因此稱為靜止相（固定相），有機溶劑稱為流動相。展層溶劑由兩個互不相溶的有機溶劑和水組成，它們互相混合時便分成兩相：一相是以水飽和了的有機相，另一相是以有機溶劑飽和了的水相。  

分配系數(α)＝溶質在固定相的濃度(CS)/溶質在流動相的濃度(CL)   

當用濾紙進行分配層析時,流動相流經支持物時與固定相之間連續抽提，使氨基酸在兩相之間不斷分配而得以分離。分配層析的原理可用一個模式解釋（英*Martin等）：把濾紙看成是一個層析柱，可以分成若干層板，設層板的物質為A、B；且A和B的分配系數（α）分別為1和1/3；又設固定相為S，流動相為L，兩相互相接觸但不相混溶。當**層流動相中加入一定量的A、B兩項物質后，溶質根據各自的分配系數在**層的兩相中分配，流動相繼續在流動，此時**層固定相與新流到的流動相之間以及原來**層流動相與第二層固 定相之間進行第二次分配，以此類推三次分配即可看出A與B**濃部分以分開，A在第二層**濃，B在第三層**濃，如果繼續抽提下去，經過若干此后，A、兩物質便可完全分開。顯然，分配系數越大的,則越易分開。  

物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的：        

 Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離 

 

在一定的條件下某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統；層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。 

 

無色物質的層析圖譜可用光譜法或顯色法鑒定。本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、 ph、時間影響較大。如果要使結果重復，必須嚴格控制上述條件。 

  

二、實驗材料與方法 

1、實驗試劑 

1. 氨基酸標準液（1mg/ml） 

     四種氨基酸是甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、混合氨酸分別配置成一定濃度的溶液 2. 80%甲酸3. 0.5%茚三酮溶液 4. 氨基酸混合液 5. 正丁醇 

2、實驗器材 

1. 新華濾紙 2. 培養皿 

3. 電熱鼓風干燥箱 4. 點樣管及點樣架 5. 針、線、尺 6. 燒杯 7. 鐘罩 #p#分頁標題#e#

 

3、實驗操作 

（一）標準氨基酸紙上層析      1、單向上行層析 

     （1）氨基酸Rf值的測定  A、 濾紙：選用*產新華1號濾紙，28cmX28cm，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，

于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點樣處，圈直徑不超過0.5cm。 

B、 點樣：點樣要合適，樣品點的太濃，斑點易擴散或拉長，以致分離不清，氨基酸的點

樣量以每種氨基酸含5—20ug為宜，將準備好的濾紙懸掛在點樣架上，濾紙垂直桌面，用點樣管吸取氨基酸樣品10ug，在濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣中心，這時樣品就自動流出。點樣的擴散直徑控制在0.5cm之內，點樣過程中必須在**滴樣品干后再點第二滴。     

C、 將點好的樣品的濾紙倆側比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處的紙的倆邊不要接

觸，避免由于毛細管現象使溶劑沿倆邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。  

D、 酸溶劑系統：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2，茚三酮2ml，溫度25*C，時間1h。注意：

使用的溶劑系統需新鮮配制，并要搖勻。展層溶劑每張約需25ml。    

E、 顯色：待展層基本結束后，置65.C鼓風箱中10—20min, 鼓風保溫，濾紙上即顯出紫

紅色黃色斑點。 

F、 Rf值的計算：用尺測量顯色斑點的中點與原點之間的距離和原點到溶劑前沿的距離，

求出此值，即得氨基酸的Rf值，計算出4種氨基酸在酸系統中的Rf值。  

  

三、實驗數據與分析