薄層層析溶劑/展開(kāi)劑/顯色劑的選擇配制及注意事

項(xiàng) 

 

摘要： 

薄層色譜方法總結(jié)：使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比(如正丁醇 - 冰乙酸 - 水= 4：1：1，V/V/V)，或者**量(如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇)。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC 板的浸入深度約為5mm。展開(kāi)劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相(上層或下層)，備用 

相關(guān)專題薄層層析（TLC）技術(shù) 薄層色譜方法總結(jié) 1.方法原理 

(1)流動(dòng)相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過(guò)固定相。 

(2) 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過(guò)程中由于偶極 - (誘導(dǎo)) - 偶極相互作用， 

氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機(jī)理。 2.溶劑 

使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比(如正丁醇 - 冰乙酸 - 水= 4：1：1，V/V/V)，或者**量(如18ml 甲苯 + 2 ml 甲醇)。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC 板的浸入深度約為5mm。展開(kāi)劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相(上層或下層)，備用。 

一、溶劑選擇規(guī)則： 

1、 考慮分離成分的極性、溶解度、吸附度。 

2、 先加入極性較小的溶劑，若不容再加入少量極性大的溶劑 3、 一般根據(jù)相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶。 4、 混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級(jí)性溶劑組成的混合溶劑。 

5、 展開(kāi)劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的該類化合物用什么樣的展開(kāi)劑，就shou先嘗試使用該類展開(kāi)劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。 

6、 一般把兩種溶劑混合時(shí),采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開(kāi)的跡象,再調(diào)整比例(或者加入第三種溶劑),達(dá)到**佳效果;如果沒(méi)有分開(kāi)的跡象(斑點(diǎn)較“拖”)，**好是換溶劑。 二、展開(kāi)劑的選擇條件： 

① 對(duì)的所需成分有良好的溶解性; ②可使成分間分開(kāi); 

② 待測(cè)組分的Rf在0.2~0.8之間，定量測(cè)定在0.3～0.5之間; ③ 不與待測(cè)組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng); ⑤沸點(diǎn)適中，黏度較小; ⑥展開(kāi)后組分斑點(diǎn)圓且集中; ⑦混合溶劑**好用新鮮配制。 三、溶劑極性參數(shù)表 

環(huán)已烷 :-0.2、石油醚(Ⅰ類，30~60℃)、石油醚(Ⅱ類，60~90℃)、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2 

1、一般來(lái)說(shuō)，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離; 

2、中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離; 3、強(qiáng)極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來(lái)調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。 四、展開(kāi)劑的選擇 物質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團(tuán)部分的增加，總體的極性就增加，展開(kāi)劑極性也增加了。 

以下分開(kāi)討論不同化合物極性情況及其對(duì)應(yīng)的展開(kāi)劑。 1、類極性較小的揮發(fā)性物質(zhì) 

冰片：石油醚(30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、 厚樸酚：苯-醋酸乙酯(9:1.5)、 α-香附酮：苯-醋酯乙酯-冰醋酸(92:5:5)、 丹皮酚：環(huán)己烷-醋酸乙酯(3:1)， 結(jié)論：以石油醚、正構(gòu)烷和苯為體積百分?jǐn)?shù)比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而用醋酸乙酯為調(diào)節(jié)Rf(比移值)的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當(dāng)加入添加劑，如有機(jī)酸或者有機(jī)堿。 2、類極性較小的不揮發(fā)性物質(zhì) 

β -谷甾醇：環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲醇(6:2.5:1)或者環(huán)己烷-丙酮(5:2)、 

熊果酸：甲苯-醋酸乙酯-冰醋酸(12:4:0.5)、 齊墩果酸：氯仿-甲醇(40:1)、 豬去氧膽酸：氯仿-乙醚-冰醋酸(2:2:1)、 

大黃素：苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇(8:1)、 

丹參酮ⅡA：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、 穿心蓮內(nèi)酯：氯仿-無(wú)水乙醇(9:1) 靛玉紅、靛藍(lán)氯仿-乙醇(9:1)或者苯-氯仿-丙酮(5:4:1) 結(jié)論：這類物質(zhì)展開(kāi)劑極性比極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)洗脫力強(qiáng)一些，因?yàn)檫@類物質(zhì)極性小的母核大，而極性大的基團(tuán)通?？梢孕纬蓺滏I，比如羧酸、羥基。以上物質(zhì)，母核分子量減小、母核結(jié)構(gòu)中不飽和健的增加(尤其是出現(xiàn)苯環(huán))，極性基團(tuán)的增加，都使極性增加，展開(kāi)劑極性也增大。。這個(gè)范圍內(nèi)的物質(zhì)很多，一般展開(kāi)劑大百分?jǐn)?shù)的溶劑可以從環(huán)己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的順序，按照極性要求選擇。這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數(shù)也比較小，在這范圍的化合物很少用，因?yàn)檎承源?、展開(kāi)慢，造成斑點(diǎn)擴(kuò)散;另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。調(diào)節(jié)Rf值的溶劑，從醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。揮發(fā)性物質(zhì)也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發(fā)性就可以明白，分子間作用力不強(qiáng)，另外，母核與石油醚、正構(gòu)烷和苯的結(jié)構(gòu)差異小，估計(jì)更容易脫離硅膠吸附，更快進(jìn)入溶劑中，而不需要通過(guò)提高展開(kāi)劑的極性。 由于存在糖的多羥基結(jié)構(gòu)，苷元的結(jié)構(gòu)影響變小。展開(kāi)劑中使用極性大的有機(jī)溶劑(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開(kāi)劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。 3、類極性大的小分子有機(jī)酸： #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

沒(méi)食子酸：氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團(tuán)部分的增加，總體的極性就增加，展開(kāi)劑極性也增加了。依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。相應(yīng)展開(kāi)劑分別為：正己烷—乙醚—冰醋酸(5:5:0.1)、苯-冰醋酸-甲醇(30:1:3)、氯仿-甲醇-甲酸(9:1: 0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3:6: 1)、醋酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)。 結(jié)論： 

這類物質(zhì)多數(shù)是苯乙烯母核的，這個(gè)結(jié)構(gòu)的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團(tuán)，個(gè)別有多羥基配基。皂苷的展開(kāi)劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。 4、類含氮有機(jī)物： 

鹽酸小檗堿：苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和)或正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)、 

麻黃堿：氯仿-甲醇-濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇-冰醋酸-水(8:2:1) 甘草酸銨：醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)。 

結(jié)論分析：由于NH2硅醇基的作用很強(qiáng)，在強(qiáng)極性展開(kāi)劑加有機(jī)酸、有機(jī)堿掃尾。對(duì)于極性化合物，使用正丁醇對(duì)斑點(diǎn)擴(kuò)散影響較小，因?yàn)榛衔锖凸枘z的作用強(qiáng)。 

當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑;被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對(duì)某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠)，則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。 3.TLC的通用顯色方法 

理想的顯色希望靈敏度高，斑點(diǎn)顏色穩(wěn)定、斑點(diǎn)與背景間的對(duì)比度好，斑點(diǎn)的大小及顏色的深度與物質(zhì)的量成正比，在樣品組成并不完全已知的情況下，通用顯色方法顯得尤為重要，通用顯色方法主要有： 

E/m T2KgV"p Fg4244131、紫外照射法：方便、不破壞樣品; 

Pl o;Er"m?zs? d T$V4244132、碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用; 

$b8M"}?(P [+e4244133、熒光試劑：制造熒光背景，使原來(lái)紫外下無(wú)熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯;小木蟲(chóng)學(xué)術(shù)博客J-M0D6{Rf;r 4、硫酸溶劑：對(duì)jue大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性。 4.薄層層析和紙色譜操作注意事項(xiàng) 

1、點(diǎn)樣 點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上,一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.0～1.5cm，樣點(diǎn)直徑一般不大于2mm,點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面 2、展開(kāi) 將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開(kāi)缸的展開(kāi)劑中，浸入展開(kāi)劑的深度為距原點(diǎn)5mm為宜，密封，待展開(kāi)**規(guī)定距離(一般為8～15cm)，取出薄層板，晾干，待檢測(cè)。 

注：展開(kāi)缸如需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡，可在缸中加入適量的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15-30分鐘。 3、顯色與檢視 供試品含有可見(jiàn)光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質(zhì)或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在356nm紫外光燈下觀察熒光色譜。對(duì)于可見(jiàn)光下無(wú)色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板(如GF254板)，在254nm紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質(zhì)形成的色譜。 把我的祖?zhèn)髅胤礁嬖V你吧PE(60-90)EtAc/PE=1:2 EtAc/PE/AcOH=15:5:1 EtAc/AcOH/n-Butanol/H2O=2:1:1:1 

8年來(lái)我用這四種體系,沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)什么問(wèn)題.我一直在用的是乙酸乙酯：環(huán)已烷，不斷調(diào)節(jié)比例，直到有滿意的Rf值，有拖尾時(shí)可能要加酸或堿，我一般乙酸和三乙胺。 

我用了好幾年了，都還好。不妨一試! 鋪板 

鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋;過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時(shí)間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過(guò)拿起研棒時(shí)勻漿下滴的情況來(lái)判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過(guò)載;涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對(duì)薄層鑒別的影響不是很大，影響**大的是展開(kāi)劑的配制和展開(kāi)系統(tǒng)的飽和。 點(diǎn)樣 

盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，**好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開(kāi)的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。 展開(kāi)劑配制 

選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開(kāi)劑。**不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開(kāi)缸，振搖展開(kāi)缸來(lái)配制展開(kāi)劑?；旌喜痪鶆蚝蜎](méi)有分液的展開(kāi)劑，會(huì)造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對(duì)不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的**高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計(jì)量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時(shí)候這不是必須的。展開(kāi)系統(tǒng)的飽和一般使用的是雙槽的展開(kāi)缸，一槽用來(lái)放展開(kāi)劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開(kāi)的板放入兩槽間的平臺(tái)，斜架著，蓋上展開(kāi)缸的蓋子。讓展開(kāi)劑的蒸氣充滿展開(kāi)缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時(shí)間在半個(gè)小時(shí)左右。展開(kāi)時(shí)難免要打開(kāi)蓋子把薄層板放入展開(kāi)劑中，不過(guò)對(duì)薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動(dòng)作應(yīng)該盡量輕、快。 溫濕度的控制 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

溫濕度對(duì)薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計(jì)主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性(容量因子)的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過(guò)在另一展開(kāi)槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 顯色 

噴顯色劑顯色**重要是有好的霧化器。