從個人學術性實驗室到大型的醫藥制造企業，小型或者大規模的蛋白純化通常都需要幾種類型的液相色譜儀。這些相關的大部分技術已應用了多年，但是新型柱料的發展為這些利用蛋白物理和化學特性進行分離的，經過時間考驗的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是... 

關鍵詞：蛋白離子交換分離分子物質樹脂 

  從個人學術性實驗室到大型的醫藥制造企業，小型或者大規模的蛋白純化通常都需要幾種類型的液相色譜儀。這些相關的大部分技術已應用了多年，但是新型柱料的發展為這些利用蛋白物理和化學特性進行分離的，經過時間考驗的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是凝膠過濾層析技術（gel filtration，GF），離子交換層析技術（ion exchange，IEX），羥基磷灰石層析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用層析（hydrophobic interaction，HI)，以及親和層析和高效液相色譜方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。   對于一個初接觸蛋白純化的新手而言，從哪兒下手也許是令人頭疼的一件事，但是幸運的是目前這些流程都已經逐步系統化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技術顧問Andrew Mitchell解釋道，通常利用液相色譜技術進行蛋白純化有三步：   捕獲——從細胞其它成份，比如DNA和RNA中分離需要的蛋白； 

  區分——從與目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化學特征的污染物中分離蛋白； 

  修飾——使分離得到的樣品處于可使用狀態。 

  這每一個純化的步驟都有特定的色譜層析技術和**佳的beads大小。 

  **步捕獲步驟，也就是從細胞裂解物粗成份中分離蛋白，這需要一個具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比較大，范圍比較寬（比較于bead大小平均值）的“fast flow”填料比較理想，這種填料也有利于防止目標蛋白被水解——因為速度比較快。   第二步則對分辨率要求更高，需要更好的從混合物中分離需要的成份。通常bead的大小與分辨率成反比，因此在這一部中比較小的bead比較合適。吸附性的技術，比如離子交換IEX和疏水作用HI通常被用在純化的這前兩個步驟，而凝膠過濾則會留到了**后的修飾那一步，用于小體積，高濃度的樣品。另外要注意，進行凝膠過濾層析時，樣品的體積應該保持在柱床體積的1%到4%。 

  選擇柱料的時候有兩個因素要考慮到，針對目的蛋白的選擇性和有效性——這些可以由洗脫峰的寬度來說明。其中選擇性主要是指填料與目的蛋白相互作用以及結合的能力，IEX和HI層析方法就是指目標分子與篩分介質之間的相互作用，而GF的選擇性依賴于填料的分餾范圍（fractionation range）。 

  柱料的有效性則是指層析介質洗脫樣品得到顯著層析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比較寬，那么即使是選擇性很好，分辨率仍然會被消弱”。bead越大，洗脫峰就越不集中，柱子的有效性就越低。純化洗脫相近的蛋白需要高效性，高選擇性和高效性的結合就會得到高分辨率。 

  凝膠過濾層析(gel filtration chromatography) 

  凝膠過濾法（gel filtration）也稱為排阻層析（exclusion chromatography）、凝膠層析（gel chromatography）或分子篩層析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后發展出來的技術。 

  凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質，內部具有網狀篩孔，利用球狀凝膠內的篩孔，使分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，很快就可以流出管柱，較小的分子因為進入凝膠內的篩孔，故在管柱內的停留時間較長，由此區分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下，凝膠不會吸附成份，所有欲分離物質都會被洗出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。 目前常用的凝膠包括3個主要類型：   1. Polydextran 

  Polydextran的商品名稱是Sephadex，它幾乎不溶于溶劑中，親水性強，能迅速在水和電解質溶液中膨脹，在堿性的環境中十分穩定，所以可以用堿去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的數字為凝膠吸水量再乘以10，以G-25為例，表示1克干燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml。 

  GE的Sephadex G-25柱就是這一系的產品，十分適合于快速處理不同體積的樣品，可以用在層析純化的前、中、后的任一階段，即適用于實驗室操作，也可以在生產上應用。達柱體積30％的樣品可通過簡單的一次性上柱，脫鹽并轉換道新的緩沖液中，一些不需要的低分子量的物質，如鹽分子就被洗脫了，這種產品**大的特點就是高速和高容量，處理起樣品來快速高效。   2. Polyacrylamide 

  Polyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，干粉顆粒狀，在溶劑中自動溶成膠體，依膠的分離范圍不同，分成Bio-Gel P-2**Bio-Gel P-300，P后面的數字乘以1000為**大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑，但它在極端的pH 下會被水解，水解后產生的COOH-具有離子交換的性質，因此pH 值應盡量控制在2-10之間。   3. Agarose 

  商品名Separose，屬于天然凝膠，依凝膠中干膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質，因其顆粒軟，在分離過程有時會阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會融化，故需于較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads后不能再脫水干燥，所以要在濕態中保存。凝膠和管柱的選擇： #p#分頁標題#e#

  凝膠的材質需為化學惰性，與分離物不能產生變性（denature）或是其它化學反應，**好具有能長期反復使用的穩定性，并可以在較大的pH和溫度范圍內使用。由于凝膠上的離子交換基團會吸附帶電荷的物質，產生離子交換的效果，所以凝膠上**好不具有離子交換的基團。此外，凝膠要有一定的機械強度，在層析過程中才不會變形，增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行，縮短分離時間。 

  凝膠顆粒的粗細與分離效果有直接關系，顆粒細的分離效果好，但流速慢而費時，因此要依據實際的需要來選擇。對于分子量較小的物質，一般采用polydextran或polyacrylamide材質的凝膠，大分子物質則使用agarose。 

  以Sephadex為例，Sephadex G-50可用于區分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝膠可區分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分離分子量10,000及20,000之分子，兩種都適用。 

  如果要分離的分子大小相差很多，則可選用柱高：直徑＝5：1~15：1的管柱，且管柱體積要大于4~15倍的樣品體積；如果要分離的物質之間分子量差異不大，則要選用柱高：直徑＝20：1~100：1的管柱，且管柱體積要大于25~100倍的樣品體積。   凝膠的處理： 

  商品凝膠一般是干燥的顆粒，使用前要先泡在欲使用的沖洗液中，使它充份膨脹，否則有引起凝膠柱破裂的危險。熱脹法是常用的前處理法，即把浸于沖洗液中的凝膠加熱，讓它膨脹并除去氣泡，溫度夠高的話（加溫**近沸騰）也可消毒殺菌。凝膠處理過程不能劇烈攪拌，如此易使顆粒破裂，影響流速。 

  將凝膠裝入管柱的方法有很多種，實驗室常用的方法是先在柱中加入約1/3 體積的沖洗液，邊輕輕攪伴邊將凝膠懸浮液倒入其中，等到底部沉積約1~2公分的凝膠后，打開下方出口讓水流出，上面不斷加入懸浮液，等到沉積到離頂部約3~5公分處停止，讓3~5倍柱床體積的緩沖液流過層析柱。若用polydextran的凝膠，可放入有顏色的蛋白質（如cytochrome c）流過管柱，看看色帶是否均勻下降，不均勻或出現氣泡，凝膠均需倒出重新填裝。   沖洗緩沖液僅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再將出口打開使沖洗液流到距表面1~2公厘，關閉出口，用滴管緩緩加入樣品再打開出口，樣品完全滲入凝膠內后，加入約4公分沖洗液，出口處接上收集瓶開始層析。 

  由于polydextran 和agarose都屬于多醣類，一旦微生物生長過多，分泌的酶會水解凝膠使其性質改變，為了防止這種情況發生，凝膠**好采用真空或低溫保存，但溫度不能過低使凝膠凍結。加入抑菌劑（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。長時間不用的凝膠可用干燥保存法，也就是把使用過的凝膠用水除去碎顆粒和雜質，再用不同濃度的酒精，由70%、90%到95%逐步脫水，在攝氏60~80度下烘干，不能加熱的Sepharose則用乙醚洗滌干燥。   離子交換層析（ion exchange，IEX） 

  離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。 

  離子交換層析法大致分為5個步驟：   1. 離子擴散到樹脂表面。   2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。 

  3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。   4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。  5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。 

  離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律，定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由于連續添加新的交換溶液，所以會朝正反應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。   如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，所以當溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，**后被洗下來。由于不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，**先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時），隨后是中性氨基酸，如glycine和alanine。堿性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達10~11時才出現。   樹脂材質： 

  **常見的離子交換樹脂材質是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合產生的三維網狀結構，舉例來說，Dow化學公司所生產的樹脂Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。   根據交換樹脂的性能，分為陽離子與陰離子交換樹脂。   1. 陽離子交換樹脂 

  分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類，強酸型樹脂含有－R－SO3H，中強酸型樹脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型樹脂含有－COOH或－OH。   2. 陰離子交換樹脂 

  分為強堿型、中強堿型和弱堿型三類，含有銨鹽，四級銨鹽 [ －N+(CH3)3] 為強堿型樹脂，三級以下銨鹽 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都屬弱堿型樹脂；同時具有強堿和弱堿型基團的，為中強堿型的樹脂。 

  除了樹脂以外，纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）也是常用的離子交換材質，特性是具有親水性和較大的表面積，對生物活性物質而言，是一個較為溫和的環境，同時也是大分子所適用的分離純化材質 。 

  實驗證明，纖維材質對蛋白質和核酸的分離純化效果相當好，因為離子交換纖維的種類多，能依據不同分離目的使用，且功能團基主要在表面，對生物大分子的交換十分有利。   離子交換劑的選擇： 

  離子交換劑的選擇，shou重保持欲分離物質的生物活性，以及在不同pH值環境中，此物質所帶的電荷和電性強弱。   1. 陰陽離子交換劑的選擇 

  若被分離物質帶正電荷，例如polymyxin、 cytochrome C這些堿性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故采用陽離子交換劑；其它像heparin、nucleic acid這類酸性物質，在堿性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑；如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。以胰島素（iulin）為例，它的等電點為pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用陽離子交換劑，在pH>5.3的堿性溶液中，使用陰離子交換劑。 

  簡而言之，已知等電點的物質，在高于等電點的pH條件下，因帶有負電荷，應采用陰離子交換，在低于等電點的pH下，則采用陽離子交換。未知等電點的物質，在一定pH條件下進行電泳，向陽極移動較快的物質，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動較快的物質可被陽離子交換劑吸附。   2. 緩沖液的選擇 

  緩沖液酸堿度的選擇，決定于被分離物質的等電點、穩定性、溶解度和交換劑離子的pK值。使用陰離子交換纖維時要選用低于pK值的緩沖液，若欲分離的物質屬于酸性，則緩沖液的pH值要高于該物的等電點；用陽離子交換纖維時要選用高于 pK值的緩沖液，目的物屬于堿性物質的話，緩沖液要低于該物等電點的pH值。 

  緩沖液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉淀為原則，如使用UV吸收法測樣品，那么pyridine或barbital這類會吸收UV的物質就不適用。   離子交換樹脂的前處理： 

  離子交換樹脂使用前，先以蒸餾水除去其內之雜質 ，并以NaOH和HCl處理樹脂，使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹脂先以15倍于樹脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，同樣以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。陽離子交換樹脂用15倍于樹脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。   親和層析（affinity chromatograph) 

  親和層析也稱為功能層析（function chromatography）、生物專一吸附（bioecific adsorption）或是選擇層析（selective chromatography）。所謂的親和力，即生物大分子和其配體（ligand）之間形成可逆結合的能力，如酵素和它的底物（sutrate）、抗體和抗原、激素和受體（receptor）、RNA和其互補的DNA等，親和層析就是根據這種親和力發展出來的純化方法，例如將酶的sutrate接在固體支持物上，再用此支持物填裝管柱，當含有這種酶的樣品溶液通過管柱時，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白質及雜質不被吸附，全部從層析柱流出，**后使用適當的緩沖液，將欲分離的酶從柱中洗出來，經過這些步驟便能得到純化的酶。   材質選擇： 

  要進行親和層析，ligand的選擇相當重要，ligand可以是輔酶、酶的抑制劑或抗體，具備的條件如下： 

  1. 能與要分離的物質進行專一性的結合，親和力愈大愈好。 

  2. Ligand與分子結合后，在一定的條件下又能解離，而且不會因解離破壞原本的生物活性。 

  3. Ligand上具有能連結到固體支持物上的團基，結合后不影響它與欲分離物質的結合專一性。 

  在實際操作上，若要純化的是某一種酶，則lignad選用此酶的競爭性抑制劑、底物、輔酶或是效應劑（effector ）；若是要純化酶的抑制劑，就選用此酶作為ligand；純化能與某維生素結合的蛋白質，可以使用這種維生素當ligand；純化激素的受體（receptor），選用激素當ligand。純化核酸可利用核酸與蛋白質的交互作用、DNA之間的互補關系、DNA與RNA的hybridization，運用適當的ligand。 

  親和層析中與ligand連接的支持物多為凝膠，凝膠應具備以下條件：   1. 不溶于水，但具有親水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分離物。   2. 化學惰性，沒有（或極少）離子交換這一類非專一性的結合。   3. 具有足夠的化學團基，經活化后能與大量的ligand結合。   4. **好是均一的球狀顆粒，制成的管柱才能有較佳的流速。   5. 具有多孔網狀結構，方便大分子自由通過。 

  6. 物理及化學性質穩定，不因洗出時改變的各種pH值、離子濃度、溫度或界面活性劑而改變其結構。 #p#分頁標題#e#

  親和層析法使用的支持物種類，部份與膠體過濾法重復，除了Polydextran、Polyacrylamide、Agarose以外，Ultrogel是能承受較大壓力的凝膠，流速高；cellulose 主要用于親和免疫層析，但它有非專一性吸附的性質；Bio-gla是硼硅酸鈉經高溫和酸堿處理制成的多孔玻璃，質地硬、強度高、孔徑均勻、不怕微生物侵襲，但缺點和cellulose一樣，它的表面對蛋白質也有非專一性吸附。   樣品的分離： 

  要使要分離的物質與ligand分離，通常采用改變pH、離子濃度或緩沖液的組成，使其親和力降低，有時使用0.1M醋酸或0.1M 氫氧化鈉沖洗，就能得到不錯的效果。如果純化對象與ligand的親和力不強，當連續通過大量的平衡緩沖液，就能在雜質洗出后，得到所要的物質；若親和力較強，則要使用較強的酸或堿作為沖洗液，或是添加guanidine hydrochloride，但這些溶液容易使純化對象失去生物活性；用較高濃度的ligand溶液亦可將管柱上所吸附的物質洗出，此ligand可以與管柱上的相同或相異。 

  對于親和力小的物質，上柱的樣品**好是體積小而濃度高，粘度較大的溶液，可以將一定量的ligand加到待分離的溶液中，攪拌平衡一段時間，進行過濾或離心，**后進行洗出的步驟。由于生物大分子和其ligand間達到反應平衡的速度很慢，樣品上柱的流速要盡量慢；通常親和力會隨溫度增高而降低，其中一例是將乳酸脫氫酶從管柱上的AMP洗下來時，所需的NADH濃度隨溫度增高而減少，在攝氏零度到十度間的變化尤其明顯，因此如果待分離的物質在攝氏4度可被緊密吸附，在攝氏25度以上容易被洗下來，則可在4度環境下進行親和吸附，在25度以上的環境進行洗出的步驟。 

  說到經典的親和層析柱，當然要提到GE公司的**產品Ni Sepharose High Performance填料，Ni Sepharose分有許多不同的凝膠類型，主要是根據凝膠顆粒的大小來區分，這些鎳瓊脂糖凝膠產品受到廣大科研工作者的歡迎，但基本上都是以層析系統或者散包裝出售的。所以要提一下一款His inTrap，His inTrap只需使用一臺標準的小型離心機就可以完成純化步驟。過程也就是將均一、澄清的細胞裂解物加入到柱子中就可以直接進行純化，樣品無需離心或過濾處理。所以說His inTrap省去了煩雜的樣品制備時間，節省了研究人員的勞動力，每10分鐘就可以進行一次小型純化。因為純化的時間變短，使樣品降解或者氧化的可能性也變小，也就**大程度保持了樣品蛋白的活性。 

  這個柱子的蛋白結合率達到750ug，并且與系列的添加、變性和還原試劑兼容。由于它是專門為了小體積蛋白純化而設計，這系列產品特別適合用于摸索細菌裂解物**佳蛋白純化條件。 

  在產品方面，GE還有一系列高分辨液相色譜柱：Tricorn，主要用于分析和純化包括蛋白質、肽、核酸、質粒、生物堿、抗生素、病毒、中藥活性成份等生物分子而設計的預裝柱。Tricorn 已取代HR 預裝柱，理論塔板數達35000，分辨率比平均塔板數為8000的HPLC柱高四倍，可直接連到HPLC/FPLC/AKTA 系統。 

  Tricorn 預裝柱可應用于層析聚焦、離子交換、疏水層析、分子篩等四種分離技術中。其中離子交換方面，Tricorn 提供了MiniBeads(3mm) ，MonoBeads(10mm) 和SOURCE (15mm)三種填料適合從分析到小量制備的需要；而在分子篩方面，Tricorn 提供了Superdex(窄譜) 和Superose(廣譜) 預裝柱。 

  比如說Superdex 200 5/150凝膠柱就是一個Tricon的預裝柱,床層高度為150毫米。當純化的時間、樣品和緩沖液的消耗顯得比獲得盡可能高的分辨率更為重要時，這種柱子是一個很好的選擇。Superdex 200 5/150凝膠柱可被廣泛應用，例如膜純化過程中條件的篩選、蛋白質之間相互作用的研究、快速分析單克隆抗體的純度和重組蛋白質純化過程中需要采用少量緩沖液而不需要采用更長的柱子時。柱子的高效率保證了純化過程極好的重復性，并可以在各種不同的純化系統上操作使用。 

  除了GE以外，默克在色譜*域也是世界上**的大公司之一，這個世界上**大的色譜級硅膠和在GMP條件下生產噸級二氧化硅的制造商得到了許多顧客和代理商的認可，其產品線覆蓋高效液相分析色譜HPLC*域，制備色譜*域，薄層層析色譜*域和樣品前處理。 

  它旗下的主要色譜柱包括Lichroher色譜柱、Puroher STAR 明星家族色譜柱以及整體化色譜柱Chromolith，其中puroherstar明星家族色譜柱采用合成硅膠為原料，填料的純度高，將造成分析困難的金屬含量降低**10m以下，而且，將硅膠表面的鍵合工藝進行改進，使得反相填料的酸堿耐受性提高**1.5~10.5。puroheròstar家族是采用**先進的原料和技術生產出來的色譜柱。它們融合了重現性好、壓力穩定性好的典型特征以及在分離效率、柱效高和ph穩定范圍寬的明顯優勢。 

  而Chromolith整體化HPLC色譜柱更是開辟了色譜行業的新紀元，這種柱子是目前世界上**快的色譜柱。其原理是基于一種全新的液溶膠技術，采用整體化的技術制得。它采用完全不含重金屬離子的四烷氧基硅為原料，采用**技術制備得到。chromolith柱中整體化硅膠棒的多孔體系是由完全創新的兩種孔結構組成：大孔結構和中孔結構。其中大孔的孔徑是2mm，相互交聯形成了密密麻麻的多孔網絡，保證流動相可以快速通過，卻不會造成大的反壓；填料骨架上的中孔保證了填料的比表面積，比顆粒型色譜柱的比表面積高15%(傳統顆粒型色譜柱的比表面積為65~70%)，這保證了它的柱效。#p#分頁標題#e#